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疏水层析填料质量性能对试验影响分析
点击次数:76 发布时间:2019-03-26
  疏水层析填料质量性能对试验影响分析
  一、疏水层析填料的选择
  *不同的配基的疏水填料与蛋白的结合能力强弱不同,在进行疏水层析时要对不同的疏水填料进行筛选对比。
  *同一配基的疏水层析填料由于配基密度不同,其和蛋白的的疏水作用力也不同,筛选填料时也要对不同的配机密度的疏水填料进行对比筛选。
  二、样品的性质
  蛋白质的疏水性强弱取决于其表面疏基团的分布,同时与样品缓冲液的离子强度,离子种类,pH,所处的温度都有一定的关系,在进行疏水层析时要保持恒定的温度,且要对样品缓冲液的离子种类及离子强度,pH进行筛选对比分析。
  三、层析柱反压升高或柱效下降
  1、确保压力的升高是由层析柱引起的
  检查在线滤器;从组分收样器开始断开管线,观察压力变化排除其他原因造成的压力升高。
  2、层析柱使用过程杂质的积累
  对填料进行清洗:先用0.5M的氢氧化钠洗1CV,然后用去离子水把碱洗掉(5CV),之后在用30%的异丙醇洗1CV,异丙醇洗完后用去离子水洗5CV,上样1CV 1mg/ml胃蛋白酶溶液(溶于0.1M乙酸,0.5M氯化钠,降解沉淀在层析柱上的蛋白),室温过夜,再用1.5CV 0.2M NaOH清洗,再用4CV去离子水清洗。
  3、柱床太高
  疏水层析装填高度建议在10-20cm,大于20cm反压增大。
  4、流速过快
  使用适当的流速。
  5、疏水层析填料被污染或老化
  随着填料的使用,一些杂质的积累会使层析填料的孔径发生变化(如堵塞,非特异性吸附积累,微生物污染,破碎等),导致其排阻能力发生偏差而影响分离度。此时可对填料进行CIP清洗,若清洗后还不能达到分离要求,就要更换新的填料。
  三、层析柱进气泡
  大量进行很好脱气的去离子水反相冲洗平衡层析柱(30cm/h),气泡会被逐渐带出层析柱。
  四、洗脱时没有收到目标物质或者洗脱量太少
  目标物没有与介质结合或结合量较少
  先确认目标物质是否和填料结合
  洗脱时间不够
  降低流速,延长洗脱液的保留时间
  目标物质和填料结合强度太高
  降低平衡液中盐浓度或更换盐的种类 或或更换结合能力较弱的疏水介质在 洗脱液中加入添加剂(少量去污剂或 者低浓度有机试剂)
  层析缓冲液及温度
  确保疏水层析时的温度适宜,且选择合适的缓冲液。
  疏水层析时目标物不与填料结合或结合量较低
  *确保合适的保留时间(上样速度)。
  *目标物质和疏水层析填料疏水作用力太弱,更换疏水性强的填料。
  *缓冲液的离子强度太低,提高缓冲液的离子强度。
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